FL是最常见的惰性非霍奇金淋巴瘤，其特征是经历复发-缓解循环的长病程，中位总生存期可达18年以上。FL国际预后指数（FLIPI）在比较临床试验中的结果时非常有用，但未能明确预测15％～30％早期复发的FL患者，而FL早期复发与较短的生存期相关。对来自13项随机临床研究的5,000多例FL患者进行的汇总分析证实，POD24是FL生存率（OS）低的早期临床终点。将FL患者在诊断后POD24定义为高危患者是目前比较公认的。更好地了解诊断时高危FL患者的免疫生物学特点已成为重中之重。 

数字基因表达是使用定制代码集-五种免疫效应物、六种免疫检查点、一种巨噬细胞分子，应用于具有早期和晚期FL患者的发现队列中（n = 132）。使用流式细胞术、多光谱免疫荧光和二代代测序手段进行T细胞受体库分析。免疫浸润曲线在两个独立的晚期FL患者队列中得到验证，这些患者均接受全身治疗（其中138例患者接受利妥昔单抗联合环磷酰胺、长春新碱、泼尼松方案治疗；45例患者接受利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松方案治疗），选择后者以允许比较经历POD24事件、在5年或更长时间没有进展的患者。在发现队列中，POD24被定义为诊断后24个月内的原发、难治性（低于部分反应），进展，转化或复发；在验证队列中，时间为治疗开始的24个月内。 

在发现队列中使用免疫效应物，免疫检查点和巨噬细胞基因表达的非等级聚集制作热图（图1），免疫分子在FL样品中显示出明显的聚集，其特征在于高或低表达，无论分类为免疫效应物，免疫检查点或巨噬细胞分子。研究者们进一步评估来自靶向免疫组的个体基因，将患者分为高风险和低风险子集，用于区分患者不良预后；四种免疫标记物-PD-L2,TNF,CD4,CD68-使用未调整的P值具有显著的风险比（P＜0.05，表1），其中PD-L2是区分患者不良预后的最敏感/特异性标记物。

图1 肿瘤内免疫浸润和POD24在FL中分布情况 

表1 靶向免疫组基因将患者分成高风险和低风险子集用于不良预后

研究者们选择PD-L2表达以区分FL患者活检组织的免疫浸润高（HI）（即高PD-L2）与免疫浸润低（LO）（即低PD-L2）。PD-L2表达分布在两个细胞群中，但是非CD20 +细胞中PD-L2的比例相对于CD20 +细胞中的比例更高（P=0.015，图2A）。使用先前分区模型定义的PD-L2截止值，免疫浸润LO组织中免疫效应物、免疫检查点和巨噬细胞分子的表达显著低于免疫浸润HI的组织（图2B）。 在这些组织中，免疫分子表达相互关联，清晰分组为免疫浸润HI或免疫浸润LO的表达（图2C）。为了确定T细胞蛋白质表达是否也是如此，研究者们通过流式细胞术分析了诊断时的活检组织，显示肿瘤免疫浸润HI与免疫浸润LO相比，CD3+T细胞的比例更高（平均41％vs 30％; P =0.016，图2D）。

图2. 免疫浸润HI和免疫浸润LO 在FL组织显示不同的基因和蛋白质表达模式

研究者们对FL组织进行了TCR谱系测序，限制肿瘤免疫浸润HI在FL肿瘤微环境中表现出更高的TCR谱系的克隆性扩增（图3A），并通过计算机学习算法定量分析证明CD8和PD-L1的分布密度在肿瘤免疫浸润HI和免疫浸润LO之间的差异（图3B和3C）。CD68用于定位巨噬细胞。高比例的PD-L1染色（总荧光单位百分比）分布在CD68 +巨噬细胞上（中位数，31.5％；范围，15.7％～55.7％），且这在肿瘤免疫浸润HI与免疫浸润LO中相比更高（图3D；41.7％ vs 22.8％; P =0 .032）。 

图3  肿瘤微环境（TME）中免疫浸润HI和免疫浸润LO在FL组织中克隆性扩增T细胞群和表达PD-L1的巨噬细胞的差异

POD24在亚历山德拉公主医院（PAH）发现队列中的发生率是24.4％，且是FL患者5年死亡率的有力预测因子（55.3％ vs 90.8％；风险比，0.24；P＜0.001）。与晚期疾病患者相比，POD24很少发生在局部疾病患者中（8.1％ vs 28.7％; P = 0.009）。使用之前作为免疫浸润标记的分区模型定义的PD-L2水平，比较POD24 + / - 组之间的免疫浸润水平。结果表明免疫浸润LO FL组织在POD24事件中富集（优势比[OR]，4.32; c-统计，0.81; P = 0.001）（图4A）；在有症状的79例晚期FL患者中，也出现类似结果（图4B）。在不列颠哥伦比亚癌症研究中心（BCCA）验证队列和德国低级别淋巴瘤研究组2000（GLSG2000）验证队列队中也出现相似结果（图4C、4D）。

图4  低免疫浸润在POD24事件中富集

为了研究一系列相关的遗传突变在免疫浸润HI和免疫浸润LO表型中的潜在关联，研究者比较了BCL2、KMT2D、EZH2、ARID1A、MEF2B、TNFRSF14、EP300、TP53、FOXO1、CREBBP和CARD11突变在免疫浸润HI和免疫浸润LO组织中的比例，结果显示突变在二者组织中的比例相等（图5）。 

图5  免疫基因在免疫浸润HI和免疫浸润LO的FL淋巴结中分布情况

本研究显示，通过PD-L2表达水平进行免疫浸润的评估可能是一种很有前景的工具，可帮助识别有POD24风险的FL患者。