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Science：粪便菌群移植可促进免疫难治性黑色素瘤患者的缓解

NO.4

2021-10-26 来源 : VIP说

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接受PD-1治疗的转移性黑色素瘤患者已显示出10-20%的持久完全缓解率(CR)。但大多数患者并不能对PD-1抑制剂作出反应，并且许多部分缓解的患者最终进展。在克服抗PD-1治疗耐药性的大量探索研究中，肠道菌群调节对免疫系统的发育和功能有深远的影响，成为克服PD-1单抗耐药最有希望的线索之一。

虽然暂未报道特定菌群与免疫治疗的临床反应相关¹，但粪便微生物群移植(FMT)已在临床前模型中显示出良好疗效^2-4。与接受抗PD-1治疗无效的黑色素瘤患者FMT的小鼠相比，接受应答者FMT的小鼠肿瘤内CD8+ T细胞的浸润增加，抗PD-1治疗的整体有效性增强^2-3。然而，肿瘤患者肠道菌群的调节作用尚未在临床试验中进行探究。

近日，以色列科学家发表在《Science》上的一篇文章“ Fecalmicrobiota transplant promotes response in immunotherapy-refractory melanomapatients ”报道了一项I期临床试验（NCT03353402)，该试验评估了FMT和再次诱导抗PD-1免疫治疗在难治性转移性黑色素瘤患者中的安全性、可行性和对免疫细胞的影响⁵。

试验患者纳入标准

10 例受试者：

抗PD-1治疗无效的转移性黑色素瘤患者；
携带BRAF-V600E突变患者在BRAF靶向治疗后进展。

2例FMT捐献者：

先前接受过抗PD-1治疗的转移性黑色素瘤患者，并获得至少一年完全缓解。

▼ 图1 临床试验方案流程图

口服抗生素（万古霉素和新霉素）72小时以耗竭肠道微生物菌群；
通过结肠镜和口服粪便胶囊的方法进行FMT移植获得供体粪便生物菌群；
再次诱导抗PD-1(Nivolumab)治疗；
FMT（维持性）和抗PD-1(标准剂量Nivolumab)治疗/14天，共6个周期，直至第90天（图1）；

每例受试者在试验前和第65天接受PET-CT成像（根据iRECIST标准，肿瘤消退作为产生治疗反应的判定），有临床获益的受试者在90天后继续进行抗PD-1单药治疗，每隔6-8周进行一次PET-CT检查，直至PD。

同时，在受试者肠道菌群耗竭前一周以及第7，31和65天采集粪便样本完成16S rRNA基因和宏基因组学测序，并在治疗前和治疗后第31天和第70天进行肠道和肿瘤组织活检，通过IHC和RNA-seq完成组织标本中免疫细胞浸润和活性检测。

当特定基因的差异无统计学意义时，使用基因本体论（GO）数据库进行基因组测试。第65天影像学评估后，受试者2号拒绝接受治疗后的活检，并立即撤回知情同意，剩余9例受试者进行了肠道和肿瘤组织评估。

2018年6月至2019年3月期间，10例受试者被随机分配到两组，分别接受来自供体1和供体2的FMT。受试者的中位年龄为66岁，大多数为男性(70%)，从最后一剂抗PD-1到本次试验第一剂的中位时间为113天。治疗前4例受试者PD-L1表达≥5%，3例受试者PD-L1表达阴性。

安全性方面，唯一观察到的与FMT相关的不良事件是一例受试者在第3至15天内出现轻度腹胀。1级免疫相关不良事件(IrAE)主要为关节痛，未发生中至重度irAEs(2-4级)，尽管5例受试者在既往抗PD-1治疗期间发生了此类irAEs。

临床获益方面，来自供体1组的3号受试者获得CR，5号和7号受试者获得PR（图2），并且所有应答者的无进展生存（PFS）均跨越了6个月的里程碑。在治疗期间，3号和5号受试者均在最初出现转移灶增大，随后逐渐缩小的“假性进展“现象（图3），这是由于抗肿瘤免疫细胞涌入肿瘤引起而非肿瘤细胞增殖导致的。

▼ 图2 10例FMT受试者肿瘤大小变化

▼ 图3 FMT和重新诱导免疫疗法对受试者肿瘤大小和转移灶的影响

对受试者粪便16SrRNA基因测序分析表明，所有受试者治疗后肠道菌群组成与基线有显著差异（p = 0.02，FDR = 0.05，图4）。

◆ 治疗前：供体1组和供体2组的受试者肠道菌群组成差异无统计学意义(p=0.36，FDR=0.45)，菌群丰富度相似(p=0.6，FDR=0.77)；

◆ 治疗后：供体1组受试者的肠道菌群组成与供体2组具有显著差异(p=0.001，FDR=0.003，图4)，供体2组的菌群丰富度高于供体1组(p<0.001，FDR=0.001)。

▼ 图4 基于粪便16S rRNA基因测序差异测试（β多样性，未加权UniFrac）的患者肠道菌群组成的主成分分析（PCA）图

宏基因组测序对治疗前后肠道菌群的分析显示，受试者接受治疗后的肠道菌群成分包含较高比例具有免疫治疗优势的韦荣氏菌科，而既往报道通过Tregs促进免疫耐受的双歧杆菌的相对丰度较低。两位捐献者都具有免疫治疗有利的特征，如毛螺旋菌科(供体1和2)、韦荣氏菌科(供体1)和疣微菌科(供体2)的相对丰度较高。

治疗前，3例应答患者(3、5和7号受试者)的肠道菌群组成与队列中其余患者相似；治疗后，应答者的菌群成分与来自供体1组的另外两例无应答者相比，四个分类群具有显著差异。应答者肠球菌和澳大利亚链球菌的相对丰度较高，而非典型韦荣氏球菌的相对丰度较低。然而，在所有患者中这些特定菌群的丰度与临床反应之间没有明确联系。

功能代谢数据表明，供体1组上调了乳糖和半乳糖降解I通路(logFC=1，FDR=0.015)，而供体2组上调了甲醛同化II(logFC=2.2，FDR=3.93e−6)，甲醛氧化I(logFC=2.4，FDR=0.001)和肌酐降解I(logFC=1.4，FDR=0.014)通路。治疗后，3例应答者与供体1组中其他两例无应答患者的微生物群组成比较未显示出功能或代谢方面的显著差异。

对所有可用FMT受试者进行肠道样本分析表明，治疗后，与抗原提呈细胞(APC)通过MHC I类递呈多肽和IL-1介导的信号传递相关的基因集上调(FDR=0.014和FDR=0.038)。供体1组受试者中与APCs活性、固有免疫和IL-12相关的基因集上调。相反，供体2组受试者的任何免疫相关基因集均未发生上调。

对每例患者的分析显示，代表APC的CD68+细胞在固有层的浸润增加，治疗前的总体中位数从353个/mm²增加到治疗后的569个/mm²(p=0.05，图5-6)。CD68+浸润集中在上皮下层，最靠近肠腔处。除6号受试者(供体2组，无应答)外，其余受试者治疗后CD68+浸润均增加。值得注意的是，该分析未显示出固有层中T细胞浸润增加的统计学差异，也未显示出T细胞相关基因集的富集。

▼ 图5 7号受试者治疗前和治疗后第31天乙状结肠活检的CD68+细胞IHC染色

▼ 图6 图像分析算法量化每个受试者肠道固有层内的CD68 + APC数量

对所有可用受试者的肿瘤样本分析表明，治疗后多个免疫相关基因集上调(图7)。例如，IFN-γ介导的信号通路、T细胞活化，MHC II类蛋白复合物、树突状细胞分化和T辅助1型免疫应答等。

然而与供体1组不同的是，在供体2组的肿瘤样本中，这些免疫相关基因集并未显示出统计学上的显著富集。对每例患者的分析显示，其中5例患者(受试者1、3、4、7和10号)治疗后肿瘤内CD8+T细胞浸润增加，治疗前总体中位数为89个/mm²，治疗后为282个/mm²(p=0.06，图8A-C)。5号受试者获得了接近病理的完全缓解，即治疗后肿瘤组织仅占整体活检组织的<1%，而3号和7号受试者仅获得部分病理缓解。

▼ 图7 肿瘤样本间基因集富集的条形码图

▼ 图8 FMT和重新诱导免疫疗法对转移性黑色素瘤患者肠道和肿瘤微环境中免疫活性的影响

对常见肿瘤内免疫活性相关基因的评估显示，治疗后，1、3、5和7号受试者的肿瘤上调了效应蛋白相关基因，并产生相互耗竭反应(图8D)。然而，第10号受试者在没有效应反应的情况下上调了耗竭相关基因。

本研究证明了通过FMT技术联合抗PD-1治疗难治性转移性黑色素瘤是安全、可行和潜在有效的，而并非对比两种供体的效率。但该临床试验的一个局限性在于使用抗生素作为FMT前的肠道菌群耗竭制剂。采用抗生素制剂是因为它增强了FMT调节已报道的鼠模型中微生物群组成的能力⁶。

万古霉素-新霉素方案被报道为一种有效的人类胎盘移植前方案⁷。由于研究中所有的受试者均接受了完全相同的FMT前方案，因此作者认为抗生素的使用不会影响免疫和临床结果。然而，在目前的研究设计中不能排除这种可能性。

该治疗方式提高了部分患者肿瘤内的免疫活性，并转化为客观的临床获益，在供体2组缺乏临床反应的患者并不意味着在扩大样本量后无法观察到肿瘤缓解。FMT治疗与肠道固有层和TME中免疫细胞浸润和基因表达谱的有利转变相关，这些发现对设计肠道菌群治疗的方案具有重要意义。尽管这项研究暂时无法明确诱导产生临床获益的特定菌群特征，但这些发现支持通过调节肠道菌群来克服免疫治疗的耐药性。

参考文献

1. Gopalakrishnan Vancheswaran,Helmink Beth A,SpencerChristine N et al. The Influence of the Gut Microbiome on Cancer, Immunity, andCancer Immunotherapy.[J] .Cancer Cell, 2018, 33: 570-580.

2. Gopalakrishnan V,Spencer C N,Nezi L et al. Gutmicrobiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanomapatients.[J] .Science, 2018, 359: 97-103.

3. Matson Vyara,Fessler Jessica,Bao Riyue et al. Thecommensal microbiome is associated with anti-PD-1 efficacy in metastatic melanomapatients.[J] .Science, 2018, 359: 104-108.

4. Routy Bertrand,Le Chatelier Emmanuelle,Derosa Lisaet al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy againstepithelial tumors.[J] .Science, 2018, 359: 91-97.

5. Baruch Erez N,Youngster Ilan,Ben-Betzalel Guy etal. Fecal microbiota transplant promotes response in immunotherapy-refractorymelanoma patients.[J] .Science, 2020, undefined: undefined.

6. Ji Shou K,Yan Hui,Jiang Tao et al. Preparing theGut with Antibiotics Enhances Gut Microbiota Reprogramming Efficiency byPromoting Xenomicrobiota Colonization.[J] .Front Microbiol, 2017, 8: 1208.

7. Ni Josephine,Shen Ting-Chin David,Chen Eric Z etal. A role for bacterial urease in gut dysbiosis and Crohn's disease.[J] .SciTransl Med, 2017, 9: undefined.