医微客 - 人人学懂ADC第二期：ADC毒素特征及偶联方式

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人人学懂ADC第二期：ADC毒素特征及偶联方式

其他

2022-06-27 来源 : 洞见conjugates

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作

Payload

前期的开发的ADC使用的是FDA批准的抗癌剂的⼩分⼦Payload，例如多柔⽐星和长春新碱，但这些药物的毒性较差。由于ADC过大，估计只有2%左右的ADC被有效内化，因此毒性更高的Payload被开发为ADC的payload，其中⼤多数毒性太⼤⽽不能作为独⽴的治疗药物。

因此良好的payload的IC50需要在低纳摩尔甚至皮摩尔区域，并具有良好的物理化学性质，例如可接受的亲⽔/疏⽔平衡和良好的稳定性。

►Extremely High

IC₅₀一般低于10^-9 M；

即：比常用的化疗药物（如阿霉素，紫杉醇，5-氟尿嘧啶，氨甲蝶呤等）毒性要高2~6个数量级！

►Why Extremely High？

ADC到达肿瘤组织的数量有限（约1~2%）

肿瘤细胞表面抗原数量有限

癌细胞对ADC内化效率不容乐观

ADC的Linker不理想的稳定性造成药物提前释放

对肿瘤细胞的特异性选择是ADC成功的关键。

尽量防止payload的过早释放，以减少对周围健康组织的损伤（尽管有时需要旁观者效应）。

从商业和临床的⻆度来看，Payload分⼦也应该是化学上易于处理的，具有明确的放⼤⽣产和纯化手段。他们还应该拥有具有明确知识产权(IP) 和/或许可，且具有成本优势的合成路线。

所有这些因素在开发ADC时都应考虑。

不同Payload的细胞毒性数据时需要考虑许多问题，包括⽤于评估它们的细胞系类型、孵育时间、每孔细胞的起始数量和使⽤的测定类型（例如代谢测定），例如 MTT 或基于 ATP 的测定，例如 MTS），它们都可能影响IC50。

因此，将不同Payload直接进行⽐较具有挑战性的。

偶联方法

单抗：目前主要集中在IgG1和IgG4

●每个单抗分子中约有80-100个赖氨酸残基，其中暴露在表面的赖氨酸残基至少30个

●每个单抗分子中含有4个二硫键

已经开发了许多⽅法来将linker-payload连接到抗体上。开发的第⼀个缀合⽅法之⼀涉及位于Linker-payload末端的亲电⼦基团[例如，⻢来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 部分] 与暴露的亲核 -NH2基团内赖氨酸残基的反应。这种 “随机”偶联方法导致ADC药物的异质性。

后来通过初始或完全还原抗体的四个链间二硫键以产⽣平均数量（即，2、4、6、8）的亲核硫醇基团⽤于与亲电linker-payload的半胱氨酸偶联。尽管有所改进，但这种⽅法仍然导致ADC的不均一性[即，药物与抗体的⽐率 (DAR)为1-8]，这可能对药代动力学、耐受性和有效性等参数产⽣负⾯影响。

鉴于此目前已经开发了位点特异性偶联⽅法，例如 THIOMAB™技术。

赖氨酸残基偶联

与赖氨酸残基的末端胺偶联是⼀种早期开发的偶联⽅法，由于抗体中存在80-100 个赖氨酸，因此选择性较低。

整个IgG1抗体，以及它们与亲电⼦（⻢来酰亚胺）Linker-有效负载构建体的反应。(b) 六种最常⻅的亲电连接技术的结构：(1) NHS，(2) ⻢来酰亚胺，(3) ⼆溴⻢来酰亚胺，(4) 5-bromopentan-2-one，(5) Traut试剂和 (6) 异硫氰酸酯。

由于赖氨酸暴露于抗体外，因此基于赖氨酸的偶联非常便捷，并且赖氨酸的氨基是良好的亲核试剂。目前赖氨酸偶联反应常涉及使⽤有效负载活化酯形成稳定的酰胺键。

通过半胱氨酸偶联

IgG1、IgG2 或 IgG4 等单克隆 IgG抗体包含多个⼆硫键，这些⼆硫键被认为是⼀种均匀且同质的结构特征。经典的⼆硫键排列如下图所⽰。每个IgG 总共包含 12对链内⼆硫键，每对⼆硫键在抗体的不同区域。

链间⼆硫键是细胞毒性Payload最理想的偶联位点。对于⼈ IgG1，四对链间⼆硫键通常在缀合前⽤三（2-羧⼄基）膦 (TCEP)、⼆硫苏糖醇 (DTT) 或 2-巯基⼄胺 (2-MEA) 等试剂还原。⼀旦⽣成了游离硫醇，它们就会与含有合适的亲电部分[例如⻢来酰亚胺、NHS、 3,4-⼆溴⻢来酰亚胺等的Linker-有效负载复合物反应，从⽽生成具有混合的 DAR 和不同位置的抗体偶联物。

上图显⽰了部分还原 IgG1 抗体的⼆硫键以⽣成两个亲核硫醇基团的典型⽅法，这些硫醇基团可以与亲电⼦Linker-有效负载构建体反应（即DAR = 2）（⻢来酰亚胺偶联）。

对于 IgG1 抗体，最多可以还原四对链间⼆硫键，从⽽暴露最多八个亲核硫醇基团进行偶联。基于还原剂生成硫醇的偶联会使⼆硫键完全或部分还原，使⽤这些⽅法⽣产的 ADC 每个抗体包含多达 8 个Payload（即，高达8 的 DAR），但对抗体的稳定性可能产生影响。

位点特异性偶联

由于二硫键的还原可能破环抗体的稳定性，也会产生不均一DAR值的ADC，目前已经开发了许多定点偶联来提⾼最终ADC产品的均一性。位点特异性偶联最著名的例⼦是基因泰克公司开发的 THIOMABTM 技术。THIOMABTM技术是利用具有改造的半胱氨酸残基的⼯程化抗体。这允许Linker-有效负载与特定的半胱氨酸发生偶联，⽽不会破坏链间⼆硫键。

THIOMAB-有效负载结合物优于⾮位点特异性ADC，因为它们包含均匀分布的Linker-药物结构，通常 DAR 为2.与随机缀合的 ADC 相⽐，使⽤该技术制造的 ADC 是有效的，并且在许多体内研究中也显⽰出优越的安全特性，特别是在肝脏和⻣髓毒性⽅⾯的优越性（PS:缺点是工程化改造的抗体产量偏低）。

已经开发了其他位点特异性⼯程抗体。例如，Selenomab™ ADC 由 Scripps Research Insti tute（美国）开发，包含⼀个或多个特定位点的硒代半胱氨酸残基（下图）。硒醇基团的具有独特反应性，硒代半胱氨酸残基能够实现高效位点特异性缀合。与其他特异性偶联 ADC （天然和⾮天然氨基酸）相比，硒代半胱氨酸残基具有特别的反应性，允许在接近⽣理条件下进行快速、单步有效的反应。

点击化学共轭

已使⽤多种点击化学⽅法将Payload附加到抗体上。在这种⽅法中，使⽤含叠氮化物的试剂，例如（⼆氟烷基叠氮基）磺酸钠 (DAAS-Na)，将叠氮化物基团连接到Linker-有效负载结构的末端。然后叠氮化物官能团可以与⼆苄基环⾟炔反应(DBCO) 反应偶联到抗体上（下图 a）。点击化学的⼀个优点是反应⾮常高效，反应条件温和，通常使⽤铜催化剂（PS:缺点是需要铜催化剂）。

其他类型的共轭

除了上述基于硫醇、胺或点击伙伴的众所周知的共轭⽅法外，还有其他基于醇的共轭技术（例如，可以形成碳酸酯、醚和酯）和醛[例如通过产生甲酰甘氨酸的酶 (FGE)]、工程氨酰-tRNA 合成酶 (aaRS)、氧化唾液酸和转氨试剂。此外，新的⽅法正在出现，例如Synaffix的 GlycoConnect™技术，基于抗体上两个天然存在的聚糖锚点的初始酶修饰。然后使⽤⽆⾦属点击化学以特定位点的方式连接Payload分⼦（更详细阅读：基于糖基化的定点偶联技术）。