作者：车洋，林熠，杨天池，陈同，桑国鑫，陈琴，贺天锋

第一作者及单位：车洋，宁波市疾病预防控制中心结核病防制所；林熠，诺丁汉大学人文社会科学学院卫生经济学中心

通信作者及单位：陈琴，中国科学院大学华美医院疾病预防与健康促进科；贺天锋，宁波市疾病预防控制中心结核病防制所

Evaluation of whole-genome sequence to predict drug resistance of nine anti-tuberculosis drugs and characterize resistance genes in clinical rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Ningbo, China.

Che Y, Lin Y, Yang T, Chen T, Sang G, Chen Q, He T.

Front Public Health, 2022, 10:956171.

doi: 10.3389/fpubh.2022.956171.

PMID: 36062095.

背    景

随着利福平耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB）的出现与传播，其已然成为全球结核病防控工作面临的严峻挑战。由于RR-TB患者对治疗核心药物利福平耐药，使得患者存在痰菌阴转慢、治疗时间长及难治愈等问题，因此对RR-TB患者的早期精准治疗显得极为重要。而这其中的RR-TB患者的综合耐药特征对其化疗方案的合理制定及治疗结局具有重要意义。既往临床上对耐药性的诊断主要依靠表型药物敏感性试验（简称“药敏试验”），但表型药敏试验周期较长（约6周），且涵盖检测药物较少，已被目前的分子生物学检测技术诸如GeneXpert MTB/RIF等代替，但随着耐药机制研究的不断深入，更多新的耐药相关突变不断被发现，现有的常规分子检测技术由于其有限的耐药基因检测范围已不能更好地满足临床需求。全基因组测序技术（WGS）完整地描述了结核分枝杆菌耐药株的基因组特征，克服了传统表型药敏试验及其他分子检测的局限性，为结核分枝杆菌耐药性全面、准确、综合的判定奠定了良好的技术基础。因此，基于基因组测序数据全面、准确、快速的预测结核分枝杆菌耐药性具有重要的公共卫生和临床意义。

方    法

1.表型药敏试验：异烟肼（isoniazide，INH）、利福平（rifampicin，RIF）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）、链霉素（streptomycin，Sm）、阿米卡星（amikacin，Am）、卷曲霉素（capreomycin，Cm）、左氧氟沙星（levofloxacin，Lfx）、丙硫异烟胺（prothionamide，Pto）及对氨基水杨酸（para-aminosalicylic acid ，PAS）的耐药检测采用世界卫生组织/国际防痨和肺病联合会（WHO/IUATLD）《耐药监测指南》推荐的1%比例法，含药培养基中药物终浓度依次分别为0.2、40、2.0、4.0 、30、40、2.0、40、1.0 µg/ml。每批次药敏试验检测采用结核分枝杆菌H37Rv标准株作为质控菌株。

2.全基因测序：按照CTAB方法制备基因组DNA并进行测序，测序基于Illumina平台构建文库，测序深度为100×。使用内部Perl脚本分析原始数据，基于TB-profiler等耐药基因数据库，应用Diamond、RGI等软件将测序数据目的基因与其相对应的耐药功能信息注释出来。应用RAxML软件完成系统发生树的构建以评估利福平耐药结核分枝杆菌（RR-MTB）菌株间的进化关系。

3.统计学处理：应用Epidata 3.0软件建立数据库，完成平行双录入后进行校对及整理分析。采用频数、构成比（%）等进行数据的统计描述。应用GraphPad Prism 8.0软件绘制RR-TB的热图（heatmap）。基于wilson评分置信区间法评估WGS在预测多种药物耐药性方面的敏感度、特异度、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。

结     果

1.RR-MTB耐药基线特征：收集2018年1月1日至2019年12月30日期间的704株临床分离株中，有59株（8.38%）为RR-MTB。其中，MDR-MTB占83.05%，Pre-XDR-MTB占27.12%，XDR-MTB占11.86%；分别有83.05%、100.00%、33.90%、 64.41%、13.56%、8.47%、38.98%、25.42%和16.95%分别对INH、RIF、EMB、Sm、Am、Cm、Lfx、Pto和PAS耐药。具体见表1。

表1 利福平耐药结核分枝杆菌耐药基线情况

2.RR-MTB多种耐药相关基因突变特征分析：RR-MTB中与INH耐药性相关的最常见的突变是katG Ser315Thr，其次是是fabG1−8T>C。与RIF耐药相关的突变为rpoB基因，可在100%的样本中检测到，所有分离株在rpoB利福平耐药决定区（RRDR，81 bp）均有突变。最常见的突变是rpoB Ser531。与Sm耐药相关的基因突变主要分布在gid、rspL和rrs。EMB耐药相关基因常见突变类型主要为Met306Val[52.94%（18/34）]和Met306Ile[23.53%（8/34）]。38.98%的分离株发生了Lfx耐药相关基因的突变，最常见突变类型为Asp94Gly[65.22%（15/23）]。所有对Am耐药的分离株中均发现rrs基因突变，突变类型均为1401a>g。Cm耐药相关基因rrs突变的主要类型也为1401a>g。93.33%的RR-MTB分离株均具有与Pto耐药相关的基因突变，常见的突变类型为fabG1 （t-8c）和ethA 基因（ethA 11a-ins、ethA 13a-ins 和 ethA 11a-dup）。PAS耐药相关基因突变类型主要为folC Ile43Ser和thyX（c-16t）。

3.基于WGS预测耐药与表型药敏试验结果比较：与表型药敏试验结果相比，基于WGS预测9种药物耐药性的一致性平均为93.79%，最低为EMB（76.27%），最高为RIF（100.00%）。基于WGS预测9种药物耐药性的敏感度范围为70.00%～100.00%，特异度范围为64.10%～100.00%。基于WGS预测耐药性的敏感度和特异度最高的3种药物为RIF、INH和Lfx，敏感度和特异度最低的为PAS和EMB。具体见表2。

表2  RR-MTB临床分离株中WGS预测耐药与表型药敏试验结果比较

4.RR-TB临床分离株系统发生树构建及基因型分析：59株RR-MTB临床分离株的系统发生树构建情况见图1。基因型谱系分析显示，89.83%的RR-MTB属于lineage2（East-Asian），具体的同源性分析结果见图2。

图1  59株RR-MTB临床分离株的系统发生树构建情况

图2  59 株RR-MTB临床分离株的SNP差异热图

结 论

WGS技术在利福平耐药临床分离株中预测INH、RIF、EMB、Sm、Am、Cm、Lfx、Pto和PAS的耐药性具有较好的应用价值。

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供稿：车    洋

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-09-20

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