急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia，AML)的特征是未成熟髓系前体的克隆增殖与分化阻滞。与正常造血相似，AML是分层组织的，白血病干细胞(LSCs)负责补充大量AML细胞，并驱动长期克隆生长。尽管干细胞在正常和恶性造血中发挥着至关重要的角色，但调节白血病和正常干细胞生长和分化的因素尚未完全阐明。

线粒体中产生的代谢中间产物——包括乙酰辅酶A，α-酮戊二酸，S-腺苷甲硫氨酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸——通过作为核基因表观遗传修饰的辅助因子来调节干细胞功能和分化。类似地，代谢酶如异柠檬酸脱氢酶1和2 (IDH1和IDH2)的突变产生致癌代谢物，导致组蛋白和DNA甲基化增加，促进白血病发生和分化抑制。虽然已经描述了调节干细胞功能的代谢物，但对线粒体代谢酶知之甚少，线粒体代谢酶在细胞核中“moonlight”，直接影响基因表达、细胞分化和干细胞功能。

1. HK2定位于白血病和正常造血干细胞的细胞核

为了探究这种传统定位于线粒体也可以在细胞核中发挥作用的蛋白，作者寻找了存在于8227细胞(低传代原发性AML模型)细胞核中的线粒体糖酵解酶和三羧酸循环酶，然后在8227细胞的细胞核中检测到HK2。相比之下，其他代谢酶（包括磷酸果糖激酶、延胡索酸酶、丙酮酸激酶2等）在核裂解液中并未检测到（图1a）。接下来，作者在7个原发性AML样本中也检测到了核HK2。进一步，根据活性氧水平的高低，作者将原发性AML样本分细分为白血病干细胞（stem population）和大量群体（bulk population），并检测了这两组样品中的核HK2水平。与bulk cells相比，干细胞核HK2的表达显著增强（1d）。

图1：（a）对FACS分选的干细胞和群体8227细胞的细胞核、细胞质和全细胞裂解液中的糖酵解酶和三羧酸循环酶进行western bloting；（d）细胞核HK2在AML (n = 25)和AML细胞系患者样本中的表达。

作者还探究了HK2在正常造血干细胞和祖细胞中的核表达和功能。造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）和多能祖细胞中HK2的核表达水平和总水平均较高，并随着细胞成熟而下降，分化细胞中核HK2的表达量最小（图2a）。正常脐带血中核HK2的过表达增加了这些细胞移植到小鼠体内的原发性和次级移植率（图2b，c）。进一步，作者构建了过表达核HK2的转基因小鼠（Vav-NLS-HK2），选择性地增加造血系统中的HK2。Vav-NLS-HK2小鼠骨髓中HSCs丰度及增殖能力显著增加，表明核HK2对正常HSCs的功能也很重要。

图2：（a）脐血造血细胞群中核HK2的荧光强度；（b）将富含CD34+的正常造血细胞与NLS1-HK2或对照载体一起转导，注入NOD/SCID-GF小鼠右股骨；（c）将（b）细胞注射到继发小鼠体内，8周后用流式细胞术检测移植效率

2. 核HK2过表达可以增加白血病干细胞特性并降低分化，敲低细胞核HK2促进分化并降低干细胞功能

为了检验AML干细胞和祖细胞功能是否需要核HK2，作者构建了c-Myc（NLS1, PAAKRVKLD）或SV40（NLS2, PKKKRKV）核定位信号标记的HK2，选择性地增加细胞核中的HK2，发现核HK2过表达可以抑制ATRA诱导的NB4细胞分化。进一步，HK2的过表达促进8227细胞植入小鼠骨髓（图3g）。作者接下来构建了特异性线粒体定位HK2载体OMMLS-HK2（outer mitochondrial membrane-localizing signal, OMMLS）。与对照细胞相比，表达OMMLS-HK2的细胞对2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）具有更强的抵抗性（图3b），表明线粒体标记的蛋白质具有代谢活性。随后，作者用靶向内源HK2的shRNA转导过表达OMMLS-HK2的细胞以消除核HK2，同时保留线粒体中的HK2（图3c）。结果显示，核HK2敲低后，（1）降低了NB4细胞的克隆生长（图3d）和8227 LSCs（CD34⁺CD38^-）数量（图3f）；（2）减少了AML细胞在体内的生长和移植；（3）降低了与原始/干细胞样AML组分相关基因的表达，增加了细胞对ATRA的敏感性（图3d和e）；（4）降低了ATRA处理后CD34⁺CD38⁻干细胞的百分比（图3f）。这些数据表明，核HK2对于AML中的干细胞功能和分化至关重要。

图3：（a）使用蓝色荧光蛋白(BFP)表达载体，将8227个细胞转导为NLS1-HK2或对照。使用共聚焦显微镜对BFP分选细胞成像；（b）2-DG在OMMLS-HK2和对照NB4细胞处理48 h后的一半最大抑制浓度(IC50)；（c）AML患者体内ROS低的LSCs和ROS高的大块原代细胞中HK2的共聚焦显微镜图像。（d）用靶向HK2 UTR的shRNAs转导的OMMLS-HK2 NB4细胞的克隆生长，并用ATRA(100 nM)处理；（e）shRNA转导至HK2-UTR并经ATRA(100 nM)处理的OMMLS-HK2 NB4细胞中CD11b的表达水平；（f）8227个OMMLS-HK2和HK2-UTR shrna转导的细胞中CD34+CD38−细胞的百分率，与100 nM ATRA孵育或不孵育24小时；（g）将f细胞注射到继发小鼠体内，8周后用流式细胞术检测移植效率

3. 核HK2调控干细胞功能和分化不依赖于其激酶活性和代谢功能

作者接下来研究了HK2核定位的机制。总所周知，HK2是一种转移酶激酶，可将线粒体外膜处的葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，开启糖酵解。那么HK2激酶活性是否是维持干细胞特性所必需的？Asp209和Asp657（D209A/D657A）的双重突变将使HK2完全丧失激酶活性。作者构建了一个带有c-Myc NLS标记的HK2突变体（NLS1-HK2 D209A/D567A）。在细胞中过表达NLS1-HK2 D209A/D567A后，用ATRA进行处理，依旧可以增强克隆生长和阻断细胞分化，与过表达野生型核HK2的表型类似（图4c,d）。因此，核HK2以一种独立于其激酶和代谢活性的方式维持干细胞和祖细胞功能。

图4：（c）经NLS1-HK2、NLS2-HK2或NLS1-HK2 D209A/D657A转导并经ATRA (100 nM)处理的NB4细胞中CD11b的表达;(d)由NLS1-HK2、NLS2-HK2或NLS1-HK2 D209A/D657A转导并经ATRA处理的NB4细胞的克隆生长。

4. HK2调节染色质开放性，增强DNA损伤反应

为了明确HK2调节干细胞功能的分子机制，作者通过邻近依赖生物素标记实验(BioID)并结合蛋白质谱分析对与HK2相互作用的核蛋白进行鉴定。通过该实验，证实了内源性HK2与MAX、SIRT1、IWS1、CTR9和SPIN1之间的相互作用（图5b）。随后，作者通过ATAC-seq发现，核HK2的过表达增加了染色质的可及性（图5c）。HK2与myc相关因子X（MYC-associated factor X，MAX）相互作用，MAX与细胞增殖、干细胞维持和分化以及DNA损伤响应有关，作者因此检测了stem和bulk AML群中的DNA损伤响应，并探究了核HK2是否会影响DNA损伤修复。在细胞中过表达核HK2后，用daunorubicin（一种插入化疗剂，可导致双链DNA断裂）处理细胞；然后，通过量化细胞核中γH2AX（双链断裂的替代标志物）、53BP1（介导非同源末端连接修复）和RAD51（同源重组）水平，在daunorubicin处理后的多个时间点检测双链DNA断裂和DNA修复蛋白的表达。结果显示，核HK2过表达增加了53BP1和RAD51水平，并减少了双链断裂的数量（图5h）。作者还比较了AML stem与bulk细胞中的DNA损伤反应。白血病干细胞对 DNA 损伤有反应，与同源重组和非同源末端连接相关的基因表达增加（图5k,i）。表明核HK2的过表达能够增强细胞的DNA损伤反应。

图5：（b）NB4细胞内源性HK2和MAX、SIRT1、IWS1、CTR9和SPIN1的PLA信号强度;(c)在NB4细胞中过表达NLS1-HK2后，通过ATAC-seq测量染色质可及性;(h)彗星实验检测了8227个NLS1-HK2转导细胞与70 nM柔红霉素孵育6 h前后的差异; (k) 在50 nM柔红霉素治疗0和3小时后，AML(AML151258)患者的原始样本中茎和体部分的γH2AX水平;从两种生物样本中选取一种，检测225个细胞。(l)AML (AML151258)患者在接受50 nM柔红霉素治疗3小时后，其主要样本的茎和体部分中53BP1的水平;从两种生物样本中的一种中检测了N = 111个细胞。