作者：朱萍，蔡铃，刘巧，张李，周刘柱，姜慧君，王洪生，王建明，陈进

第一作者及单位：朱萍和蔡铃，南京医科大学公共卫生学院全球健康中心；刘巧，江苏省疾病预防控制中心慢传所

通信作者及单位：王洪生，主任医师/博导，中国医学科学院皮肤病研究所/南京医科大学公卫学院全球健康中心；王建明，教授/博导，南京医科大学公卫学院；陈进，教授/博导，东南大学兼职博导，江苏特聘教授，南京医科大学公共卫生学院/全球健康中心/南京医科大学卫健委抗体技术重点实验室/江苏省抗体药物工程研究中心

One-pot synthesis of α-Linolenic acid nanoemulsion-templated drug-loaded silica mesocomposites as efficient bactericide against drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.

Zhu P, Cai L, Liu Q, Feng S, Ruan H, Zhang L, Zhou L, Jiang H, Wang H, Wang J, Chen J.

Eur J Pharm Sci, 2022, 176:106261.

doi: 10.1016/j.ejps.2022.106261.

PMID: 35840102.

研究背景

结核病是一种严重的传染病，已成为健康不良的主要原因。尽管发病率最近缓慢下降，但据报告2019年有1000多万例罹患结核病。此外，耐多药结核病或利福平耐药结核病正日益威胁公共卫生。利用纳米技术开发一种有效、环保和安全的治疗方案，可有效防止包括耐药结核分枝杆菌感染的微生物感染问题。本研究以α-亚麻酸（α-LA）为模板，采用超声辅助纳米乳液一锅水热法制备了介孔氧化硅纳米颗粒。在水/脂肪酸表面形成的氧化硅介孔复合物提供了一种简单而绿色的合成途径，可推广用于进一步封装抗分枝杆菌利福平等疏水性药物，对药物敏感和耐药的结核分枝杆菌均表现出良好的抗菌活性。所制备的具有高度生物相容性、生物安全性和低能耗的含α-亚麻酸的介孔氧化硅基杀菌剂在应对耐药微生物感染方面具有很好的应用前景。

研究方案

一、α-亚麻酸纳米乳剂模板化纳米氧化硅纳米颗粒的制备

制备的纳米乳液配方由油相α-亚麻酸、去离子水、表面活性剂吐温80和助表面活性剂乙醇共同构成。首先充分混合吐温80和α-亚麻酸，超声制备α-亚麻酸纳米乳液（LE），再加入正硅酸甲酯（TMOS）搅拌，水热法制备α亚麻酸纳米乳模板化氧化硅纳米颗粒（LNS NPs）；通过无水乙醇回流除去模板中α-亚麻酸和吐温80获得去模板剂的介孔氧化硅纳米颗粒命名为LNS-1 NPs。姜黄素（CCM）作为细胞内摄取药物模型；异烟肼（INH）和利福平（RIF）用于抗分枝杆菌实验。

二、材料表征

采用扫描电镜、透射电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线光电子能谱、XRD、Zeta电位和氮气吸脱附实验对制备的材料进行表征。

三、抗菌活性和机制探索

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）的模型菌株，采用平板涂布法对纳米粒子的抗菌活性进行评价。采用H37RV和利福平耐药结核分枝杆菌（M.tuberculosis）来评估抗结核分枝杆菌活性。

以谷胱甘肽（GSH）损失率作为不依赖ROS氧化应激通路的指标，通过Ellman’s实验评估LNS纳米颗粒的氧化能力。为了进一步研究其抗菌机制是否与ROS依赖性氧化应激引起的细胞损伤有关，研究采用DCFH-DA法检测抗菌过程中ROS的产生。

研究结果

一、LNS纳米颗粒的制备

以α-亚麻酸纳米乳剂为模板剂，一锅法制备了核-壳型介孔氧化硅纳米复合材料（示意图）。

示意图  采用α-亚麻酸纳米乳作为模板制备载药介孔硅纳米颗粒（LNS NPs）及对结核分枝杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌示意图

二、纳米颗粒的表征

如图1A～D所示，从SEM图像和TEM图像中观察到均匀的球形颗粒。纳米颗粒的孔隙通道通过TEM图像可观测到。纳米颗粒的EDX光谱（图1E、1F）证实了元素组分；Si、C和O的EDX图像（图1G、1H）显示LNS和LNS-1的元素分布均匀。图1I所示，当一束光穿过样品溶液瓶时，可以从垂直入射光的方向观察到明亮的“通路”，是胶体溶液典型的丁达尔效应特征。纳米颗粒LNS和LNS-1的zeta电位分别为-20.30 mV和-29.10 mV，表明两种纳米颗粒表面带负电荷。然而，相较于LNS纳米颗粒，LNS-1的电位值更负，这与去除模板后介孔硅球的孔道中更多的Si-OH基团暴露有关（图1J）。

图1  LNS（A）和LNS-1（C）的透射电镜图像, inset是部分放大图；LNS（B）和LNS-1（D）的扫描电镜图像；LNS（E）和LNS-1（F）的元素分析结果；LNS（G）和LNS-1（H）的HADDF-STEM图像和C、O、Si的元素分布图；I：经过激光束照射的制备的乳液（LE）照片；J：样品的Zeta电位

三、介孔氧化硅复合材料的抗菌活性和机制研究

以S.aureus和E.coli分别为G+和G-的模式菌株，评价纳米颗粒的抗菌性能。用光学图像记录了处理后细菌的生长状态。

图2A所示，相较于对照组，LNS纳米颗粒低剂量组（50 μg/ml）即对S.aureus表现出明显的抑制作用，100 μg/ml时则仅有少量菌落生长；而在LNS纳米颗粒高浓度处理组（200 μg/ml）时，平板上几乎没有菌落生长。可见LNS的抗菌活性呈现出浓度依赖性关系。而LNS-1纳米颗粒不具备抗菌活性，这是由于其不含活性抗菌成分α-亚麻酸。

图2B所示，复合材料LNS纳米颗粒对E.coli的抑菌效果不明显，仅在1 mg/ml时表现出对菌落的部分抑制作用。这是因为材料中的抗菌活性因子α-亚麻酸对E.coli的抗菌效果较差，而这可能与E.coli的外膜脂多糖层结构有关，E.coli外膜是抑制疏水物质通过的有效屏障。

图2  不同浓度的LNS和LNS-1 NPs在12和24 h时对金黄色葡萄球菌（A）和大肠杆菌（B）的抗菌效果

通过Ellman的测定使用GSH作为氧化应激状态的指标来评估LNS NPs的氧化能力。如图3A所示，LNS NPs的氧化能力对GSH反应的浓度和时间均有轻微的依赖性。当LNS NPs暴露于500 μg/ml的LNS纳米颗粒4 h后，GSH的氧化率仅达到26%。因此，LNS纳米颗粒的主要抗菌作用不是由于还原型GSH的氧化引起。

为了进一步研究其抗菌机制是否与ROS依赖性氧化应激引起细胞损伤有关，我们采用DCFH-DA法检测抗菌过程中ROS的产生。如图3B所示，纳米颗粒处理组别的荧光强度与阴性对照组的荧光强度基本一致，差异无统计学意义，因此可以排除在抗菌过程中活性氧途径的可能性。

图3  A：不同浓度和暴露时间下的GSH损耗率；B：LNS处理组的ROS荧光强度

通过扫描电镜观察LNS NPs处理的金黄色葡萄球菌细胞的形态变化。如图4A所示，与阴性对照相比，金黄色葡萄球菌细胞膜变得起皱，并且在LNS NPs处理下可以观察到膜破裂，这表明抗菌机制与膜损伤有关。同时，通过透射电镜观察可以观察到金黄色葡萄球菌细胞膜损伤和细胞质渗漏（图4B）。

图4  A：分别用阴性对照和LNS NPs处理的金黄色葡萄球菌的扫描图像；B：分别用阴性对照和LNS NPs处理的金黄色葡萄球菌的透射电镜图像。C：纳米颗粒和金黄色葡萄球菌共孵育后核酸泄露定量

四、介孔氧化硅复合材料的抗结核分枝杆菌活性

为了进一步研究纳米颗粒对传染性微生物的消杀能力，将4种不同浓度（25～200 μl）载药硅球分别加入到结核分枝杆菌培养基中。第7天时在任何一组中均未观察到快速生长的结核分枝杆菌，并且在整个观察期间未观察到介质污染。图5显示了H37Rv或利福平耐药结核分枝杆菌第4周生长的典型图像。除使用100 μl和200 μl 的RIF+INH@LNS处理组外，所有组均观察到阳性菌落生长。结核分枝杆菌生长的计数结果见表1。而100 μl和200 μl RIF+INH@LNS处理组在整个观察期内以及培养第8周后，培养基均未发现H37Rv和利福平耐药结核分枝杆菌。其他剂量的RIF+INH@LNS处理组和其他材料组均未发现显著的抗菌作用。其中，RIF + INH@LNS处理组显示出较RIF + INH@γ-LNS处理组更显著的抗分枝杆菌活性，可能是由于α-亚麻酸和γ-亚麻酸的分子结构的差异性。值得注意的是，RIF+INH@LNS处理组在利福平耐药结核分枝杆菌中也显示出优异的抗分枝杆菌性能，这表明所制备的含α-亚麻酸介孔氧化硅基杀菌剂对治疗耐药微生物的有效性。

图5  在LJ培养基中孵育4周后，不同剂量的LNS纳米颗粒对H37Rv和利福平耐药结核分枝杆菌的作用效果照片

表1  载药硅球和耐药结核分枝杆菌共孵育的菌落计数结果

研究结论

在本研究中，以低能耗的α-亚麻酸纳米乳液为模板构建了一种新型、绿色、经济的介孔氧化硅杀菌剂，这为包括姜黄素在内的疏水性药物的封装提供了一种可行且通用的策略。此外，基于使用α-亚麻酸纳米乳液作为模板负载异烟肼和利福平，所制备的载药LNS纳米粒表现出优越的抗分枝杆菌活性，可有效消除对利福平耐药的结核分枝杆菌。

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供稿：陈    进

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-07-29

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