1.使用CRISPR / Cas9技术将人类ACE2（血管紧张素转化酶2）敲入小鼠体内

2. SARS-CoV-2会在肺、气管和大脑中大量复制

3. SARS-CoV-2引起老年hACE2小鼠间质性肺炎和细胞因子升高

4. 高剂量SARS-CoV-2可在hACE2小鼠胃内引起感染

 研究人员首先将hACE2的完整cDNA插入到小鼠体内位于x染色体上的GRC m38.p6位点的mACE2基因的第一个编码外显子Exon2 (图1)中，从而沉默mACE2基因，终止其表达，使得小鼠只表达hACE2而不表达mACE2，生成稳定表达hACE2的纯合子小鼠模型，并将其命名为hACE2- KI /NIFDC小鼠(简称hACE2小鼠)。

图1.将hACE2基因插入位于X染色体上的GRC m38.p6位点，小鼠ACE2的第一个编码外显子Exon2上

然后，为了进一步研究hACE2小鼠感染SARS-CoV-2的能力，用4 * 10⁵ PFU 的SARS-CoV-2鼻内感染青年(4.5周龄)和老年(30周龄)hACE2小鼠，以接受相同病毒量的WT C57BL/6小鼠为对照组（图2A）。每天监测所有小鼠的临床症状和体重变化，并在感染后的第6天杀死小鼠。结果表明，接种后的小鼠均未出现明显的临床症状，只有老龄hACE2小鼠在接种第三天时体重下降10%，随后恢复。在年轻和年老的hACE2小鼠的肺、气管和脑组织中都可以看到病毒RNA复制旺盛，而在脾脏、肾脏、肝脏、肠道和血清中则没有检测到病毒（图2B）；在野生型C57BL / 6小鼠的任何组织或血清中没有检测到病毒RNA。另外，研究人员还在老年hACE2小鼠的粪便中检测到高水平的病毒RNA(2.9* 10⁵ copies/g)。通过对小鼠肺切片进一步免疫染色，发现青年、老年hACE2小鼠气道均检测到了病毒S蛋白，而在接种SARS-CoV-2的WT小鼠气道未能检测到病毒S蛋白(图2C)。为了确定模型中SARS-CoV-2的主要靶细胞，研究人员进一步用不同的细胞标记对感染hACE2小鼠的肺切片进行了染色，染色结果表明CC10⁺ Clara细胞是模型中SARS-CoV-2沿气道的主要靶细胞(图2D)。这些结果表明，与野生型小鼠相比，hACE2小鼠对SARS-CoV-2的鼻内感染高度敏感，病毒RNA在肺Clara细胞、气管和大脑中复制旺盛。

图2. A. 用4×10⁵ PFU的SARS-CoV-2病毒鼻内感染WT C57BL/6小鼠，青年（4.5周龄）和老年（30周龄）的hACE2小鼠（n = 3) ,并在接种后第六天杀死小鼠收集组织；B. SARS-CoV-2病毒RNA的组织分布；C. 小鼠肺石蜡切片免疫荧光染色，SARS-CoV-2 S蛋白(绿色)，ACE2(红色)，DAPI(蓝色)；D. 肺感染细胞的免疫荧光染色分析。hACE2(白色)、CC10(红色)、β-IV-Tubulin(青色)、PDPN(品红)和SPC(金色)。

接着，为了验证感染SARS-CoV-2的hACE2小鼠是否产生了与新冠肺炎患者相似的病理特征，对感染SARS-CoV-2的小鼠的肺切片进行组织病理学检查、免疫组化(IHC)和免疫荧光染色。结果显示，与SARS-CoV-2感染的野生型小鼠比较，青年和老年hACE2小鼠均发生间质性肺炎，表现为炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚和血管系统损伤。老年小鼠肺泡上皮细胞病变较多，局灶性出血较多(图3A)。相比WT小鼠，免疫组化染色分析显示SARS-CoV-2感染引起老年hACE2小鼠更多中性粒细胞(Neu⁺)和巨噬细胞(CD68⁺)浸润(图3B和3C)。免疫荧光染色显示SARS-CoV-2直接感染肺内CD68⁺巨噬细胞，导致老年hACE2小鼠C-Casp3⁺凋亡显著(图3D)。另外，与青年小鼠相比，细胞因子分析显示感染SARS-CoV-2后老年hACE2小鼠中产生更多的细胞因子，包括Eotaxin（嗜酸性粒细胞趋化因子），G-CSF（粒细胞集落刺激因子）, IFN-g（干扰素）, IL-9（白细胞介素9）和mip -1b（巨噬细胞炎症蛋白1b）(图3E)。因此可以看出，hACE2小鼠体内不仅病毒复制旺盛，而且感染SARS-CoV-2后会引起小鼠肺部病理变化。

图3.A. 染色结果显示hACE2小鼠炎症细胞浸润(黄色箭头)、肺泡间隔增厚、局灶性出血(绿色箭头)和血管系统损伤(蓝色箭头)；B和C. hACE2小鼠感染SARS-CoV-2后中性粒细胞(Neu⁺)和巨噬细胞(CD68⁺)免疫组化染色分析；D. 石蜡肺切片免疫荧光分析；E. 感染SARS-CoV-2后小鼠血清中细胞因子的产生

SARS-CoV-2主要通过飞沫和人的密切接触传播，但部分患者出现腹泻、腹痛、呕吐等胃肠道症状，在新冠肺炎患者的粪便中也检测到病毒RNA。基于此，研究人员通过对小鼠进行SARS-CoV-2灌胃处理，研究SARS-CoV-2是否能通过胃内途径在hACE2小鼠中建立生产性感染（图4A）。虽然接种的3只hACE2小鼠没有表现出临床症状，但有两只小鼠的气管(2.9 *10⁶ copies/g)和肺(3.2 *10⁶ copies/g)中检测到高水平的病毒RNA(图4B), 这与经鼻途径感染的小鼠相当。另外，在hACE2小鼠的肺气道中也检测到SARS-CoV-2 S蛋白的表达(图4C)，研究人员还观察到经灌胃处理感染SARS-CoV-2的hACE2小鼠发生间质炎症，肺泡间隔增厚(图4D)。结果表明，通过对hACE2小鼠灌胃SARS-CoV-2也可以建立生产性感染，并导致小鼠的肺部病理改变。

图4.A. 用4×10⁶ PFU的SARS-CoV-2病毒对4.5周龄WT C57BL/6小鼠和hACE2小鼠(n = 3)进行灌胃处理，并在接种第5天时杀死小鼠采集主要组织和血清；B. 组织中SARS-CoV-2病毒RNA的分布；C. 小鼠肺切片免疫荧光染色，SARS-CoV-2 S蛋白(绿色)和DAPI染色(蓝色)；D. 小鼠肺切片的组织病理学分析，黄色箭头示肺泡间隔增厚。

综上，hACE2小鼠通过鼻内和胃内两种方式均可实现SARS-CoV-2的感染，在肺Clara细胞和巨噬细胞中病毒复制旺盛. 其中老年hACE2小鼠表现出的病理变化与COVID-19病人的病理变化更为接近。hACE2小鼠模型为研究SARS-CoV-2的传播和发病机制提供了一个小动物模型，并为了解人类感染SARS-CoV-2后的临床表现提供了依据，同时，这一模型对测试对抗SARS-CoV-2的疫苗和治疗方法也有价值。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312820303024