miMOMP发生在细胞衰老过程中

图1 亚致死线粒体凋亡信号转导是细胞衰老的一个特征

为了研究miMOMP是否是细胞衰老的一个特征，作者对增殖或衰老的人成纤维细胞进行了3D结构照明显微镜(SIM)分析，并分析了外线粒体膜蛋白TOM20和细胞色素c (Cyt c)之间的共定位。在衰老细胞中，作者观察到外周线粒体的一个亚群(与网络分离并呈现球状结构)TOM20阳性，但Cyt c不阳性(图1a)。在辐射诱导的衰老细胞(Sen IR)和复制性衰老细胞中，胞质Cyt c增加，Cyt c和TOM20的共定位减少(图1b-e)。

接下来，作者研究了miMOMP是否伴随着BAX齐聚(表明BAX活化)。使用尺寸排除色谱法分析BAX齐聚性，结果显示BAX在衰老细胞中形成齐聚物，但不增殖(图1f)。在衰老细胞中，从主网络分离的外周球状线粒体显示激活的BAX表达增加(图1g)。在两种独立的人成纤维细胞株(MRC5和IMR90)和辐照诱导(Sen IR)和致癌基因诱导(OIS)衰老中观察到BAX激活增加(图1h,i)。这些数据表明，在衰老过程中存在亚致死凋亡应激产生的miMOMP。

衰老时细胞质线粒体DNA增加

图2 衰老细胞胞质线粒体DNA水平增加

在细胞凋亡过程中，MOMP导致mtDNA释放到细胞质中。作者推测，线粒体在经历miMOMP过程中也可能释放mtDNA进入衰老细胞的胞质中。作者发现衰老成纤维细胞胞浆中含有大量的DNA类核 (图2a,b)。通过免疫金标记透射电镜观察到衰老细胞中胞浆类核增加(图2c)。定量PCR特异性检测发现DNA类核是否来源于线粒体(图2d)。为了进一步支持细胞质DNA的线粒体起源，作者发现大多数细胞质DNA与转录因子A (TFAM，线粒体)共定位，这是mtDNA类核的核心成分之一(图2e,f)。细胞质分离证实了TFAM在衰老细胞的细胞质中富集(图2g)。这些结果表明，TFAM结合的mtDNA类核存在于衰老细胞的细胞质中。

miMOMP是SASP的驱动程序

图3 BAX和BAK介导衰老细胞mtDNA释放和SASP

作者使用CRISPR-Cas9基因编辑来产生BAX和BAK都缺乏的人类成纤维细胞(图3a)。BAX和BAK联合缺失可抑制DNA损伤诱导的衰老细胞中mtDNA的释放(图3b)。BAX和BAK缺失后，常见的SASP基因减少(图3c,d)。BAX和BAK的缺失不会改变周期素依赖性激酶抑制剂p21和p16INK4a的表达或增加SA-β-Gal活性(图3e-j)。增殖标志物Ki-67的表达(图3k,m)或衰老细胞中正常下调的增殖基因的表达均未发生变化(图3l)。这些数据表明，BAX和BAK调节SASP，而不是衰老相关的细胞周期阻滞。

mtDNA通过cGAS-STING驱动SASP

图4 胞质mtDNA驱动衰老细胞中的SASP 

在线粒体缺失的衰老细胞中，qPCR检测不到mtDNA，转染mtDNA后，mtDNA显著增加(图4a-c)。常见SASP因子IL-6和IL-8的分泌在线粒体清除后受到抑制，在mtDNA再次引入后部分恢复(图4d)。大部分mtDNA应激诱导的干扰素刺激基因（ISGs）在衰老过程中上调，线粒体清除后降低，mtDNA重新引入后恢复(图4e)。mtDNA的缺失导致SASP主要成分IL-6和IL-8的分泌显著减少(图4g)。总之，胞质mtDNA驱动衰老细胞中的SASP。

抑制MOMP可以提高健康寿命

图5 胞质mtDNA驱动衰老细胞中的SASP

作者接下来评估是否可以使用MOMP的药物抑制剂抑制mtDNA的释放和SASP。作者研究了BAX小分子抑制剂BAI1，它可以抑制BAX激活的构象事件，阻止BAX线粒体易位和寡聚。接下来我们研究了BAI1是否影响衰老。BAI1在MRC5和IMR90（两种细胞系）中有效地阻止mtDNA释放，BAX激活和SASP(图5a,b)。为了研究MOMP抑制是否可以改善衰老过程中的衰弱表型，作者用BAI1治疗(20个月)老年小鼠3个月(图6c)。BAI1治疗可以改善年龄相关的神经肌肉协调能力的下降 (图5c-d)。此外，BAI1治疗改善了老年小鼠前肢的握力，并延缓了年龄相关衰弱症状的进展 (图5e,f)。

作者进行微计算机断层扫描(µ-CT)分析，以研究BAX抑制对骨微结构的影响(图5g)。BAI1治疗有效地改善了脊柱和股骨小梁骨的微结构，BAX抑制剂处理的动物脊柱和股骨小梁数量显著增加，小梁分离减少，股骨骨体积分数更高(图5h-j)。此外，BAI1治疗可以有效地显著降低骨中几种促炎SASP因子的mRNA表达(图5k)。

为了阐明BAI1治疗的效果，作者进行单细胞RNA-seq (scRNA-seq)，在BAI1治疗后，所有脑细胞群中p16INK4a阳性（衰老）细胞的频率显著降低(图5l,m)。这些发现强调了靶向miMOMP作为一种治疗策略的潜力，以缓解大脑老化中的炎症和细胞衰老。

MOMP通常是凋亡细胞死亡的必要因素，被认为是与细胞衰老和免疫沉默无关的终端细胞命运。作者的研究结果表明，miMOMP发生在细胞衰老过程中，可以通过释放mtDNA到胞质中驱动SASP。重要的是，抑制miMOMP可能是一种治疗靶点，可以抵消与年龄相关的无菌性炎症并改善健康寿命。这些结果证明线粒体外膜透化也是衰老的驱动因素。鉴于线粒体外膜透化也是癌症的驱动因素。因此，抑制线粒体外膜透化的药物，可能是抗衰老、抗癌和对抗其他与衰老相关疾病的通用药物。

本研究的创新之处在于作者的发现更新了通常被广泛接受的观点，即在之前的认知里，一个细胞中所有线粒体的外膜透化，是同步发生的：要么所有线粒体全部发生外膜透化，然后细胞凋亡；要么都不发生外膜透化，细胞正常存活，没有中间状态。因此，作者的这一发现，改写了普遍认知，将这一现象命名为“少数线粒体外膜透化”（少数MOMP）。首次发现少数线粒体外膜透化是细胞衰老的一个特征，并揭示了少数线粒体外膜透化促衰老的机制。这一发现为学界开展其他线粒体外膜透化作用的研究，提供了先例。