目前有多种方法和平台可用于ROS1重排/融合检测，每一种方法都有其内在优势和缺陷，而内在缺陷有可能导致ROS1重排/融合改变漏检。这项研究中采用3种方法检测ROS1重排/融合状态，结果证实，每种方法都无法发现所有ROS1重排/融合阳性标本。

共有23例已证实为ROS1重排/融合阳性的标本，每个标本采用至少2种检测方法重新进行检测，方法包括断裂分离荧光原位杂交（FISH），DNA杂交捕获后行新一代测序（NGS）和RNA锚定多相聚合酶链反应后行NGS。

没有一种检测方法能100%检测到所有标本的ROS1重排/融合。FISH假阴性结果为2/20（图1），以DNA为基础的NGS假阴性结果为4/18，以RNA为基础的NGS假阴性结果为3/19。

一些进展期NSCLC患者未能得到最佳治疗，与分子检测手段局限性导致假阴性结果有关，其中就包括ROS1重排/融合改变常常漏检，ROS1重排/融合假阴性意味着本是ROS1重排/融合阳性的肺癌失去了接受克唑替尼靶向治疗或其它在研药物治疗的机会，因此应当给予重视。

该研究评估了3种ROS1检测方法，无一种方法对ROS1重排/融合状态的检测准确率可达100%，其中还包括ROS1重排/融合检测的金标准方法-断裂分离荧光原位杂交。该检测方法出现了2例假阴性结果，一例假阴性结果是缘于大部分核表现为不典型融合，只有少数核表现为分离信号（图1C），另一例假阴性结果是因为ROS1与发生融合的GOPC基因位置紧邻，二个基因通过基因间的内含子缺失实现融合，导致检测时探针无法分离而出现假阴性（图1A和1B）。

图1 （A）模式图显示了探针杂交区域、ROS1与其配对基因GOPC间的基因缺失；（B）由于ROS1与GOPC位置紧邻，导致探针无法分离，出现FISH假阴性；（C）FISH显示了不典型融合，只有少数核有分离信号。

通过分析ROS1 DNA检测ROS1重排/融合状态的检测方法，共有4例假阴性结果，主要是由于该分析方法的内源性缺陷导致无法测定大的ROS1序列所致。第三种方法通过分析融合RNA检测ROS1重排/融合状态，造成假阴性结果的主要原因是因为RNA质量较差。因此当ROS1重排/融合检测结果阴性时，解释结果时应考虑到检测方法的局限性。

实践中少有机会采用2种或2种以上方法同时检测ROS1状态，因此在选择检测方法时应考虑标本和患者因素。ROS1重排/融合通常不与其它癌症驱动基因改变同时发生，所以ROS1重排/融合和其它癌症驱动基因改变同时阴性的标本应采用其它方法重新分析。

很多特殊检测方法的缺陷是新的知识，即使是分子病理学家可能对此也不完全清楚。没有一种检测方法完美无缺，而且这种不完美是不可避免的，这一点不仅表现在ROS1重排/融合检测上。当结果与临床不符合时，应在其它实验室采用其它方法重新检测，以确保患者有机会接受到真正的最佳治疗。

本项研究的主要研究者Davies教授所在的科罗拉多分子实验室，已开展同时进行FISH和以RNA为基础的ROS1检测，以确保每个患者有机会接受到最适合的治疗。其实验室曾发现有患者FISH检测显示ROS1重排/融合为阴性，但RNA检测则显示ROS1重排/融合阳性，患者最后接受了ROS1指导的治疗，疗效非常好。这个病例充分说明单纯依赖FISH检测结果，有可能造成假阴性结果，增加患者选择不恰当治疗手段的机会。

总之，这项研究表明断裂分离FISH、RNA为基础NGS和DNA为基础NGS均因其内在缺陷，可能导致ROS1重排/融合假阴性结果。ROS1重排/融合阳性肺癌常发生于非吸烟者，重排/融合通常不与其它癌症驱动基因改变同时发生，因此当医师从临床角度高度怀疑ROS1重排/融合结果为假阴性时，应采用不同方法重新检测。