AVENIO ctDNA检测平台是罗氏诊断基于靶向捕获测序技术推出的液体活检系列产品，旨在为研究者提供高品质的针对实体肿瘤（如肺癌、结直肠癌等）基因组分析的全方位解决方案。AVENIO ctDNA检测平台基于高通量测序平台，提供从样本提取、文库构建、靶标富集到数据分析及变异报告的一站式解决方案。从样本采集到报告生成仅需5天，大大缩短结果等待时间。AVENIO ctDNA检测平台提供3个系列产品，以满足肿瘤发展不同时期和阶段的研究需求。3个系列分别为Targeted Kit、Expanded Kit、以及Surveillance Kit。各系列均可覆盖的突变类型包括单核苷酸变异（SNV）、插入或缺失突变（InDel）、融合（Fusion）和拷贝数变异（CNV）。

液体活检技术敏感性和特异性的提高，使ctDNA动态定量监测成为可能。系列液体活检可克服治疗过程中反复组织活检的瓶颈，实现动态定量监测，有助于评估疗效和监测MRD。本研究从一项前瞻性、观察性的德国肺癌多个生物标志物的研究中选择最初连续入组的177例局部晚期或晚期肺腺癌患者，分别在患者开始治疗前（b0）、化疗第2周期前（p1）和第3周期前（p2）抽取血浆标本。在入组的177例患者中，排除III期（n=29），接受一线靶向治疗（n=23），未接受一线化疗（n=7），治疗信息未知（n=9），治疗前未采集到血浆标本（n=1）或未检查到任意基因变异的患者（n=2）。剩余的106例患者随机2:1分配进入训练集和验证集，并以性别作为分层因素。 

采用AVENIO ctDNA Surveillance Kit进行测序，这是一个覆盖197个基因的NGS 检测平台，可以动态检测每毫升血浆中的突变分子数（MMPM）。该方法通过检测所有测序序列中的分子变异，在分子水平对ctDNA进行定量。MMPM计算公式如下：MMPM=AF*提取物（ng）*每ng 330个基因当量/血浆体积（ml）。计算每个样本的平均MMPM，结果显示患者自基线开始呈总体下降趋势，如下图1。

图1. 检测血浆中的突变 

纳入分析的106例患者，71例为训练集，35例为验证集；其中训练集和验证集中分别有53例和30例在P1时采集了外周血标本，36例和28例患者在P2时采集了外周血标本。分别采用Algo-1和Algo-2两种算法对患者进行分组。 

Algo-1采用MMPM来评估疾病负荷：基于基线血浆标本中检测到的体细胞突变，检测每个样本在后续随访中的所有SNVs，计算每个样本的平均MMPM。分别采用40和8作为p1和p2时的cutoff值，将患者分为2组。训练集中，相比于p1和p2时平均MMPM均高于cutoff值的患者，平均MMPM低于cutoff值的患者PFS和OS显著更长。验证集采用相同的cutoff值分组，在p1时观察到与训练集相似的显著差异，但p2时的差异没有显著统计学意义。然而，相比与p1和p2时平均MMPM均高于cutoff值的患者，两个时点平均MMPM均低于cutoff值的患者有显著更好的OS和PFS，如下图2和3。

图2. P1时以40作为cutoff值分组，患者的PFS和OS对比

图3. P2时以8作为cutoff值分组，患者的PFS和OS对比 

Algo-2（持续响应者）: 对于每一个平均MMPM值均计算可信区间。如果患者的平均MMPM值为b0>p1>p2，且p2时的平均MMPM<8，可信区间与b0和p1未覆盖，则定义为持续响应者。此外，p1时和p2时平均MMPM均为0的患者也纳入持续响应者。在训练集中，持续响应者对比非持续响应者，OS显著更优。尽管两组PFS对比无显著统计学差异，但观察到与OS相似的趋势。在验证集中，采用相同的方法分组，虽然两组患者的PFS和OS对比没有显著统计学差异，但持续响应者的PFS和OS在数值更优（图4）。

图4. 基于p2时患者是否为持续响应者进行分组，对比两组的PFS和OS

血浆ctDNA的动态定量监测可作为长期评估实体瘤疾病负荷的指标。平均MMPM整合了每个样本中观察到的所有突变分子，可靠地定量血浆中ctDNA的浓度。在晚期肺腺癌患者中，治疗后ctDNA浓度下降与更好的预后相关；对第1或第2个治疗周期后的血浆进行检测，可以早期评估治疗疗效。这一研究提示，通过动态监测外周血中突变分子数的变化，可以较传统影像学更早的评估疗效，预测预后，从而优化患者的管理；同时，在小细胞肺癌中，也观察到与本实验结果相一直的结论（见摘要号8577）。此外，本研究的思路和算法也可适用于后续的临床研究。

在本次ASCO大会上，还报道了另外两项采用AVENIO ctDNA Surveillance Kit对肺癌患者血浆标本进行动态监测的研究。摘要号12077的研究显示，可以在缺乏配对组织活检标本的情况下，通过动态监测基线血浆ctDNA中的分子变异，早期评估肺腺癌患者的预后；摘要号12045的研究显示，在接受化疗或放化疗治疗的晚期肺癌患者中，血浆突变分子数与患者的预后相关，其中肺腺癌患者中突变分子数低与更好的OS相关，而SCLC患者中突变分子数高与更好的预后相关。这一结果提示，不同组织学类型的肺癌患者存在差异，进一步探索突变分子数的意义，可潜在预测患者的治疗疗效。 

传统研究思路中，组织和血浆样本检测结果的一致性往往是诸多平台及产品研发的追求方向。但因为组织样本异质性的存在，以及血浆样本ctDNA释放不充分等因素，两种样本检测结果差异不可避免。研究者发现组织-血浆结果的不一致性，可给临床结局的预测带来参考价值。

STEAM研究评估了同步和序贯FOLFOXIRI方案+贝伐珠单抗(BEV) vs FOLFOX方案+BEV用于转移性结直肠癌（mCRC）一线治疗的疗效和安全性。本研究探索性的分析了肿瘤组织，诱导治疗前、后血浆检测中的肿瘤异质性与患者临床结局的关系。 

采用AVENIO ctDNA Expanded and Surveillance Kits结合NGS检测肿瘤组织、诱导治疗前后的血浆标本的中的体细胞突变。肿瘤的异质性定义为：1）血浆回收率（PRR），血浆和配对肿瘤组织共有的基因变异/总的血浆基因变异，PRR=Common/Plasma；本研究中采用AVENIO ctDNA Expanded Kits检测诱导治疗前血浆和肿瘤组织标本，计算PRR，分析了90例有血浆和组织配对标本（采集时间相差<60天）的患者，其中87例可评估PRR，其余3例因血浆标本中未检测到体细胞突变无法计算PRR。2）等位基因突变肿瘤异质性（MATH）：评估等位基因突变频率（VAF）的离散度，MATH=100*MAD/VAF的中位数。在146个诱导治疗前的血浆标本中，13个标本仅检测到0或1个体细胞突变，剩余133个标本可评估MATH。在87个诱导治疗后的血浆标本中，28个标本仅检测到0或1个体细胞突变，剩余59个标本可以评估MATH。鉴于MATH计算了不同染色体间的异质性，研究者开发了染色体校正的MATH（cwMATH），这一指标考虑到特定染色体的背景异质性。3）携带多重变异的基因数（MVGC），即血浆中携带> 1个体细胞突变的基因数。

PRR值分布在0-1之间，在0.2-0.8之间平均分布（图1A）。高度不一致（PRR<0.2，即血浆和组织突变一致性<20%）主要分布在血浆样本中检测到1-7个突变，配对组织标本中检测到0-5个突变的患者（图1B）。总体人群中，组织和血浆的中位突变数分别为2个和4个。诱导治疗前，血浆和组织不一致性越大，患者的OS越短（图1C）。当采用PRR为0/（0-1）/1或>0.25/（0.25-0.75）/<0.75分别对患者进行分组时，观察到相似的结果。此外，高度不一致性还与疾病转移的范围相关（图1D）。 

图1. 采用PRR评估肿瘤的异质性

总体人群中，如果诱导治疗前患者的MATH位于最高4分位数，则归类位AF离散度高，与更短的PFS相关（图2A）。鉴于血浆中肿瘤含量可以影响检测到的突变数以及肿瘤异质量性，在探索性分析中，将平均AF纳入多因素模型。MATH与检测到的体细胞突变数（图2B）和平均AF（图2C）不相关。在多因素Cox回归模型，调整了治疗组、ECOG评分，平均AF后，cwMATH与PFS显著相关（图2D）。

图2. 采用MATH评估诱导治疗前血浆AF离散度

采用MVGC评估瘤内异质性，诱导治疗前后血浆MVGC升高的患者OS显著更短（图3A），在PFS中也观察到相似的趋势，但无统计学差异（图3B）。

图3. 采用MVGC评估瘤内异质性

图4A显示了每例患者的MATH值和每个变异基因相应的AF分布。如果诱导治疗后患者的MATH位于最高4分位数，则归类为AF离散度高，与更短的PFS相关（图4B）。MATH与体细胞突变数（图4C）或平均AF（图4D）不相关。在单因素Cox回归模型中，治疗组和平均AF与PFS相关；在多因素模型中，MATH和PFS显著相关（图4E）。

图4. 采用MATH评估诱导治疗后血浆AF离散度 

采用AVENIO ctDNA检测平台评估血浆标本的肿瘤异质性，发现其具有潜在预后作用，异质性越大，患者的预后越差。诱导治疗前的血浆标本中，PRR低和血浆AF离散度高与更短的OS相关；诱导治疗后的血浆标本中，肿瘤异质性越大与更短的OS相关。本研究的结果给了我们别出心裁的启示：利用组织-血浆的不一致性可帮助预测患者临床结局”，这一比较新颖的视角引发了读者的关注，也为后续研究提供了新的思路。

基因检测技术的迅速发展，推动了液体活检的临床应用，基于ctDNA的NGS检测已成为当下的研究热点，参与肿瘤的全程管理。血浆中cfDNA含量很低，其中ctDNA含量则少之又少，因此需要高敏感性和特异性的液体活检平台。在今年的AACR会议上，有两项研究分别报道了由罗氏诊断研发的AVENIO液体活检平台，具有非常卓越的敏感性和特异性，可以敏感检测肿瘤的微小残留病灶。在本次的ASCO大会上，AVENIO液体活检平台再次将液体活检演绎至新高度，实现从定性检测至定量检测的飞跃。上述研究结果证实，ctDNA的检测具有巨大的应用潜能：一方面，ctDNA的动态、定量检测可以预测患者的治疗疗效和预后，指导晚期肺癌的临床管理；另一方面，从基因的异质性层面分析，可能会带给我们新的研究视角和启示。相信未来，AVENIO ctDNA检测平台将真正落实于临床，参与癌症患者诊疗的全程，真正实现肿瘤的精准管理。